Contexte

L'ovogenèse chez la drosophile représente un système modèle pour l'étude des voies de signalisation intercellulaires régulant prolifération, différenciation et morphogenèse. Chez la drosophile, comme chez la grande majorité des métazoaires, l’ovogenèse se déroule au sein de follicules comprenant des cellules germinales se développant en contact étroit avec des cellules d’origine somatique les entourant (Fig. 2). La formation du follicule ovarien chez la drosophile nécessite une étroite coordination entre prolifération et différenciation des cellules germinales et somatiques. A partir d’une population de cellules souches germinales maintenue de façon continue dans l’ovaire, un cyste germinal est produit composé de 15 cellules qui se différencient en cellules nourricières et d’une cellule qui deviendra l’ovocyte. Les cellules folliculaires qui migrent autour du cyste germinal pour former le follicule proviennent d’une deuxième population de cellules souches, les cellules souches somatiques.

Fig. 2 : Chez la drosophile, chaque ovaire à maturité est composé d’environ 20 ovarioles, chacune composée d’une chaîne linéaire indépendante de follicules aussi appelés “ chambres à œuf ”. A l’intérieur de l’ovariole, les follicules ovariens se développent selon un schéma spatio-temporel précis: leur formation commence dans la partie antérieure de l’ovariole, le germarium, puis se poursuit postérieurement dans le vitellarium jusqu’à l’obtention d’un ovocyte prêt à être fécondé (Spradling, 1993). Chaque follicule est constitué de deux populations cellulaires d’origine différente : les seize cellules internes appartiennent à la lignée germinale (en bleu), alors que les cellules folliculaires épithéliales qui les entourent sont d’origine somatique (sans couleur ou jaunes). Il existe 2 à 3 cellules souches germinales (CSG) du côté le plus antérieur du germarium (région 1).

Ces cellules sont en contact avec des cellules somatiques quiescentes : les cellules de la coiffe et du filament terminal.Les CSG subissent une division asymétrique conduisant d’une part à la formation d’une cellule fille qui va s’engager dans la voie de la différenciation germinale, le cystoblaste, et d’autre part à la régénération d’une cellule souche.Au niveau des régions 1 et 2a du germarium, le cystoblaste subit 4 mitoses synchrones mais incomplètes. Les divisions conduisent à la formation de seize cellules ou cystocytes qui restent interconnectées par des ponts cytoplasmiques structurés par l’existence de canaux en anneaux: cette structure est appelée le cyste. Une structure cytosquelettique traverse tous les canaux en anneaux du cyste et oriente le plan des divisions des cystocytes: le fusome (en rouge). Les seize cystocytes adoptent une destinée différente: quinze des seize cellules donnent les cellules nourricières polyploïdes, alors qu’une seule se différencie en ovocyte se trouvant toujours en position postérièure du follicule. Ce groupe de seize cellules entre en contact avec 2 cellules souches somatiques dans la région 2a/2b du germarium, puis avec leurs cellules filles, les cellules pré-folliculaires dans la région 2b. Ces cellules précurseurs se différencient soit en cellules interfolliculaires et polaires, soit en cellules folliculaires épithéliales. Ensuite, dans la partie postérieure de la région 2b, le cyste s’entoure d’une monocouche de cellules folliculaires lors du processus d’encapsulation et forme dans la région 3 le premier follicule ovarien qui se sépare du germarium grâce à la formation de la tige interfolliculaire comprenant 5 à 7 cellules organisées de façon linéaire.

Bien qu'une communication soma-germen, nécessaire pour la mise en place des follicules ovariens, ait été démontrée par des études d'ablation au laser et transplantation de cellules germinales, l'analyse génétique de ce système ne fait que débuter. En particulier, il a été montré que des molécules de signalisation connues (Dpp/TGFb, Hedgehog) ainsi que des nouvelles molécules (Piwi) exprimées dans les cellules somatiques spécialisées (filament terminal) sont nécessaires pour la prolifération des cellules souches germinales et somatiques. Par ailleurs, les cystes germinaux matures produisent deux molécules de signalisations, Gurken/TGFa (voie EGFR) et Delta (voie Notch) permettant la différentiation des cellules folliculaires les entourant. Pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu, il est important maintenant de mieux préciser le rôle de ces voies de signalisation, de déterminer les points d’intégration entre les différentes voies et d’établir le lien entre voie de signalisation et molécules effectrices.

Thématiques

Les travaux que nous avons effectués précédemment (Institut Jacques Monod UMR 7592) et que nous poursuivons actuellement tournent autour de 3 axes :

1) Rôle de la sérine/thréonine kinase Fused et de la voie Hedgehog dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules somatiques et germinales dans l’ovaire adulte et pupal ;

2) Identification de nouveaux gènes impliqués dans la mise en place du follicule ovarien, par criblage de mutagenèses réalisées par transposition de l’élément P : mutagenèse “piège à séquence enhancer” (mobilisation de l’élément P-Gal4) et mutagenèse de dérégulation (mobilisation de l’élément P-UAS) ;

3) Mise en évidence et étude du rôle de la mort cellulaire programmée (apoptose) dans le lignage somatique conduisant à la sélection de deux paires de cellules polaires par follicule ovarie.

1) Rôle de la sérine/thréonine kinase Fused et de la voie Hedgehog dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules somatiques et germinales dans l’ovaire adulte et pupal

Le gène fused code une sérine-thréonine kinase qui a été caractérisée comme un effecteur positif de la voie de transduction du signal Hedgehog (Hh) au cours du développement embryonnaire et larvaire chez la drosophile. Nous avons entrepris l’analyse du rôle de fused et de la signalisation Hh au cours des phases précoces de l’ovogenèse à l'aide de marqueurs moléculaires et d’outils génétiques permettant d'identifier les différents stades de développement des cellules germinales et somatiques perturbés en différents contextes mutants.

Les résultats principaux sont les suivants :

1-1) La signalisation Hh est nécessaire dans le programme de développement des cellules somatiques de deux façons différentes: i) de façon “fused-indépendante” pour la prolifération des cellules-souches somatiques, ii) de façon “fused-dépendante” pour la différenciation des cellules préfolliculaires résultant de la division asymétrique des cellules-souches.

1-2) La fonction de la sérine-thréonine kinase Fused est requise pour la régulation du nombre de divisions des cellules germinales (arrêt des mitoses après 4 cycles) et pour la différenciation des cystocytes en cellules nourricières et ovocyte. Cette fonction pourrait être indépendante de la voie de signalisation Hh classique.

1-3) Fused et la signalisation Hh sont requis dans une communication soma-germen au cours de la morphogenèse de l’ovaire pupal. Nous avons montré que la répartition des cellules germinales dans les ovarioles (processus de type « sorting out ») dépend du signal Hh, exprimé spécifiquement par des cellules somatiques spécialisées de l’ovaire pupale (filament terminal), et de la transduction de ce signal, de manière Fused-dépendante, dans les cellules germinales.

2) Identification de nouveaux gènes impliqués dans la mise en place du follicule ovarien, par criblage de mutagenèses réalisées par transposition de l’élément P : mutagenèse “piège à séquence enhancer” (mobilisation de l’élément P-Gal4) et mutagenèse de dérégulation (mobilisation de l’élément P-UAS)

2-1) Mutagenèse “piège à séquence enhancer”. Le criblage d’une collection de 300 lignées a permis de sélectionner un nombre important de lignées (30) présentant des profils d’expression spécifiques des cellules somatiques de l’ovaire. Plusieurs des gènes ainsi identifiés présentent un intérêt particulier d’étude pour leur rôle ovarien. Par exemple, les gènes abelson et failed axon connections qui codent des régulateurs de la dynamique du cytosquelette d’actine et le gène eiger qui code le premier homologue connu chez un invertébré des Tumor Necrosis Factors (TNF) de mammifères.

2-2) Mutagenèse de dérégulation. Nous avons réalisé cette mutagenèse dans le cadre d’un consortium de dix équipes française coordonnées par Hervé Tricoire (Projet Génome - MRT). Le criblage de 2500 lignées sur le critère de stérilité femelle a permis de sélectionner plusieurs lignées intéressantes. L’une d’entre elles correspond à l’insertion de l’élément P-UAS dans le gène polyhomeotic-proximal (ph). Ce gène fait partie des gènes du groupe Polycomb, régulateurs négatifs de l’expression des gènes homéotiques via le modelage de la chromatine. C’est la première fois qu’un rôle dans l’ovogenèse précoce est mis en évidence pour ce type de protéine. L’étude du rôle de ph montre qu’il est requis spécifiquement dans la lignée somatique pour le contrôle de la prolifération et la différenciation des cellules préfolliculaires au cours de la formation du follicule ovarien. L’étude a été étendue aux autres gènes du groupe Polycomb et nous avons montré que deux d’entre eux sont également impliqués dans l’ovogenèse précoce.

Fig. 3 : Elimination par apoptose des cellules polaires surnuméraires pendant les stades précoces de l’ovogenèse chez des femelles sauvages de drosophile. Ovariole triplement marquée avec du DAPI révélant tous les noyaux (A,a1), des anticorps anti- b galactosidase révélant l’expression du gène lacZ sous le contrôle d’un promoteur spécifiquement actif dans les cellules polaires (rouge-A’,a2,a3), et du TUNEL révélant la mort cellulaire par apoptose. Un jeune follicule qui bourgeonne du germarium (astérisques A,A’) contient trois cellules exprimant un marqueur des cellules polaires (rouge-A’ boîte,a2,a3) parmi lesquelles une est en train de mourir par apoptose (vert-a2).

3) Mise en évidence et étude du rôle de la mort cellulaire programmée (apoptose) dans le lignage somatique conduisant à la sélection de deux paires de cellules polaires par follicule ovarien

Précédemment, nous avons caractérisé, chez les femelles sauvages, le programme de différenciation au sein du lignage de cellules somatiques spécialisées de l’ovaire, les cellules polaires, et montré qu’un mécanisme impliquant la mort cellulaire programmée permet la sélection d’exactement deux cellules parmi en moyenne 6 précurseurs de cellules polaires produites à chaque extrémité du follicule ovarien (Fig. 3). Nous avons également montré que, d’une part, la survie d’un excès de cellules polaires peut être induite par une surexpression de l’anti-caspase de bacullovirus, p35, spécifiquement dans ce lignage cellulaire (Fig. 4), et d’autre part, les cellules polaires destinées à mourir expriment le gène codant le facteur pro-apoptotique de drosophile, reaper. Plus récemment, les résultats d’une analyse de clones homozygotes mutants H99 (délétion du complexe des 3 gènes pro-apoptotiques reaper, hid et grim) indiquent que les fonctions de Reaper, Hid et Grim sont impliqués dans l’apoptose des cellules polaires. Enfin, la réduction du nombre de cellules polaires est indispensable pour obtenir le bon patron de différenciation des cellules folliculaires adjacentes dans la partie antérieure du follicule ovarien (cellules bordantes, cellules squameuses). Ainsi, ces résultats confortent les modèles qui proposent que les cellules polaires sont la source des morphogènes induisant les diverses destinées des cellules de l’épithélium folliculaire. Nous avons ainsi identifié un nouveau système pour l’étude de la régulation de la mort cellulaire programmée par apoptose chez un organisme modèle facilitant une analyse génétique. Le projet que nous poursuivons actuellement consiste à identifier par crible génétique des effecteurs intracellulaires et extracellulaires régulant la mort par apoptose dans le lignage de cellules polaires.

Fig. 4 : L’expression de la protéine anti-apoptotique P35 de bacullovirus conduit à la survie prolongée des cellules polaires surnuméraires jusqu’aux stades tardifs de l’ovogenèse chez la drosophile.
Deux approches différentes ont été utilisées pour exprimer la protéine anti-apoptotique P35 de bacullovirus dans l’ovaire chez la drosophile utilisant le système UAS-Gal4. Premièrement, chez les femelles hsp _prom -flp/+; +/UAS-p35; act _prom FRTcd2FRT-gal4,UAS-GFP/+ des clones ont été induits dans lesquels une expression forte du transgène UAS-p35 est obtenue grâce à la reconstitution du pilote actine _prom -gal4 (système flipase-FRT). Dans la deuxième approche, une activation transcriptionnelle du transgène UAS-p35 spécifiquement dans le lignage de cellules polaires est obtenue grâce à la construction pilote neur _prom -gal4. (A,A’) Follicule ovarien d’une femelle contrôle hsp _prom -flp/+; +/SM6; act _prom FRTcd2FRT-gal4,UAS-GFP/+ marqué avec du DAPI révélant l’age du follicule (stade 5-6) et des anticorps anti-Fascicline III (FIII) marquant une paire de cellules polaires au pôle antérieur du follicule (têtes de flèches -A’). (B,B’) Follicule ovarien d’une femelle hsp _prom -flp/+; +/UAS-p35; act _prom FRTcd2FRT-gal4,UAS-GFP/+ marqué avec du DAPI révélant l’age du follicule (stade 5-6) et des anticorps anti-FIII révélant la présence d’un groupe de 5 cellules polaires au pôle antérieure (tête de flèche-B’), ce qui n’est jamais observé dans le contrôle à ce stade de l’ovogenèse. Toutes les cellules des ovarioles dans A et B expriment la GFP indiquant la reconstitution flipase-dépendante du pilote actin _prom -gal4 permettant l’expression des transgènes UAS-GFP et UAS-p35. (C,C) Follicule ovarien d’une femelle UAS-p35 /neur _prom -gal4; UAS-Histone2A:YFP/+ marqué avec du DAPI révélant l’âge du follicule (stade 8-9) et des anticorps anti-FIII révélant un groupe de 4 cellules polaires au pôle du follicule ce qui n’est jamais observé dans le contrôle à ce stade de l’ovogenèse. La détection de la YFP dans les 4 cellules polaires indique l’activité du transgène pilote neur _prom -Gal4 induisant l’expression des transgènes UAS-YFP et UAS-p35.