Une réussite biotechnologique :

la synthèse totale d'un médicament par une levure humanisée

Cette réussite biotechnologique, qui sera publiée dans le numéro de février 2003 de la revue Nature Biotechnology (l'accès en ligne sera possible dès le 6 janvier), est le fruit d'une collaboration exemplaire entre le CNRS et la Société Aventis-Pharma. Ce travail, qui a également impliqué d'autres partenaires académiques et industriels Français (ESTBB à Bordeaux, Transgène à Strasbourg) se place dans le cadre d'un projet de grande envergure visant à développer à l'échelle industrielle la synthèse totalement biotechnologique de médicaments.

L'article publié décrit la construction d'une souche de levure produisant certaines hormones stéroïdiennes, en particulier un médicament anti-inflammatoire majeur : l'hydrocortisone. Les stéroïdes sont en effet largement utilisés comme médicaments (anti-inflammatoires, agents contraceptifs, anticancéreux et antivieillissement). La principale voie actuelle de production de l'hydrocortisone est une hémi-synthèse qui utilise des acides biliaires ou des phytostérols comme point de départ d'un processus industriel associant de nombreuses étapes de conversion chimique et une étape de bioconversion impliquant un micro-organismes naturel. Toutefois, ce processus qui fait principalement appel à la chimie fine reste relativement complexe, coûteux et générateur de sous-produits.

La réalisation de la biosynthèse totale de stéroïdes et en particulier de l'hydrocortisone par un micro-organisme capable de fabriquer de manière totalement autonome ces molécules à partir de simples sources de carbone (alcool, sucre) et d'oxygène (air) représente une avancée décisive tant en matière de compétitivité industrielle que de développement de nouveaux processus industriels de synthèse respectueux de l'environnement. C'est précisément ce à quoi viennent d'aboutir les équipes d'Aventis et du Centre de Génétique Moléculaire du CNRS à Gif-sur-Yvette, en introduisant dans la levure de boulanger, Saccharomyces cerevisiae, des gènes appartenant aussi bien au bœuf, à l'homme, qu'à une plante, et en détournant ou reprogrammant certaines étapes métaboliques de ce micro-organisme.

Ce succès a été rendu possible par un partenariat très étroit entre la recherche publique, au travers du CNRS, et le groupe pharmaceutique Aventis-Pharma, qui a fait le pari audacieux de soutenir une recherche à long terme mettant en oeuvre les techniques les plus modernes de génomique et l'ingénierie génétique et moléculaire. Le procédé développé est potentiellement extrapolable à la production par une "chimie verte" d'une très variété de molécules d'intérêt en matière de santé humaine ou animale. Ce saut technologique majeur a été rendu possible en particulier par l'accumulation récentes d'informations sur la séquence du génome de nombreuses espèces : microorganismes, plantes et homme.

© Denis POMPON, 2003

Contact CNRS :
Dr. Denis Pompon
CNRS-Centre de Génétique Moléculaire
91198 Gif-sur-Yvette Cedex

Tél.: 01 69 82 36 80
Fax : 01 69 82 36 82
Mél : pompon@cgm.cnrs-gif.fr

Voie artificielle de biosynthèse de l'hydrocortisone reconstruite chez la levure

Les enzymes en rouge proviennent de l'homme, du bœuf et de plantes et leurs gènes ont été reconstruits avant d'être introduits chez la levure

Les enzymes en bleu sont des enzymes de levure dont les gènes ont été aussi modifiés pour changer leurs niveaux d'expression.

Le chemin en vert est le chemin principal menant à la production d'hydrocortisone.

Les chemins en rouge correspondent à des réactions parasites qui ont été contrôlées

Les chemins en jaune à des voies minoritaires de synthèse qui coexistent avec la voie principale.

Du détournement de métabolisme à la synthèse de médicaments

ou

"Comment construire une usine plus petite qu'une tête d'épingle ?"

La plupart des médicaments sont des molécules organiques complexes. Lorsqu'il s'agit de molécules naturelles, un premier mode d'obtention consiste à les extraire par des processus physico-chimiques à partir de substances naturelles (végétales, par exemple). C'est ce que l'on fait sans le savoir en préparant une tisane. Néanmoins, ces sources naturelles sont souvent peu abondantes, coûteuses et posent des problèmes écologiques.

La seconde manière d'y parvenir, plus généralement employée, est la synthèse chimique. Celle-ci peut être totale, en partant de corps simples comme l'eau, le carbone et l'azote, ou partielle (on parle d'hémisynthèse) lorsque la molécule de départ est déjà complexe (un peptide, un sucre, un stérol, etc.). Les synthèses chimiques mettent en oeuvre des procédés industriels complexes générant souvent de nombreux sous-produits qu'il faut éliminer pour éviter tout risque de pollution. Ces procédés sont souvent longs et coûteux, justifiant un prix parfois élevé de la molécule active obtenue en fin de chaîne. A l'inverse, les être vivants arrivent à réaliser au sein de chacune de leurs cellules des synthèses chimiques d'une incroyable complexité avec une très grande efficacité, et ce, pratiquement sans sous-produits. Ils doivent ces propriétés remarquables aux "nano-machines de synthèse" que constituent les enzymes. Ces catalyseurs biologiques sont capables de réaliser chacun une étape de synthèse avec une extrême précision et d'enchaîner ces étapes de façon à éviter toute perte de matériel ou toute dérive vers des produits non voulus.

L'association d'étapes de synthèse chimique à des étapes enzymatiques est aujourd'hui de plus en plus utilisée au niveau industriel, au moins lorsque des enzymes adéquates existent (de nouvelles technologies permettront probablement d'en créer à la demande dans le futur). Cependant, le caractère fragile et coûteux de ces catalyseurs en limite sévèrement l'usage pour la production de produits industriels. Une solution permettant de réduire ces coûts est l'utilisation non plus d'enzymes isolées (purifiées) mais de micro-organismes (bactéries, levures, champignons) capables de les produire naturellement en leur sein. De tels micro-organismes naturels sont largement utilisés depuis très longtemps, par exemple dans l'industrie alimentaire : fromages, yoghourts, vin et bière leur doivent leur goût et nombre de leurs agréables propriétés.

Plus récemment, le développement du génie génétique (ensemble des méthodes permettant d'extraire, de modifier et de transférer des gènes) a permis la construction d'organismes génétiquement modifiés.pour répondre à ses propres besoins, l'homme réalise ainsi à son échelle de temps et à ses fins ce que la nature fait au rythme lent de l'évolution. Le génie génétique a permis d'isoler de nouveaux gènes d'intérêt et de faire produire en grande quantité à des micro-organismes les enzymes précises dont le chimiste a besoin pour mener à bien ses synthèses. Cette approche a permis de réduire significativement le coût d'étapes de synthèse biotechnologiques isolées. L'outil reste toutefois imparfait, beaucoup d'étapes devant continuer à être effectuées par la chimie classique.

L'idée est alors née de re-programmer massivement un être vivant (généralement un micro-organisme) afin de le transformer en une véritable usine chimique, capable d'effectuer non une ou deux étapes d'une synthèse, mais le processus dans son entier, sans aucune intervention extérieure. Le comble du raffinement a été de demander à "l'usine biologique" de produire sa propre énergie, c'est-à-dire au micro-organisme d'assurer la fourniture énergétique pour des étapes de synthèse grandes consommatrices d'énergie (souvent sous forme d'électrons). Cette re-programmation massive implique l'utilisation du génie génétique pour extraire, remanier et transférer l'ensemble des gènes utiles, donc des fonctions enzymatiques correspondantes, dans un même micro-organisme.

Néanmoins, la biosynthèse totale des structures complexes des médicaments à partir de molécules simples, comme un sucre, nécessite un nombre considérable de catalyseurs enzymatiques. Ce nombre très élevé rend la tâche de reformatage génétique excessivement complexe. On a donc dû tout d'abord choisir un micro-organisme hôte sachant fabriquer naturellement des molécules ressemblant au plus près à certains des intermédiaires de synthèse du médicament d'intérêt. Ces molécules "précurseurs" ne sont en général pour l'organisme que de simples intermédiaires dans la fabrication des molécules qui lui sont utiles... mais qui, en général, n'ont pas d'intérêt pharmaceutique. On doit alors tenter de détourner son métabolisme, c'est-à-dire l'empêcher d'utiliser normalement ces intermédiaires de façon à ce qu'ils s'accumulent et que l'on puisse s'en servir comme produits de départ pour la fabrication du médicament visé. Cette première étape du détournement se fait en général en détruisant sélectivement un certain nombre de gènes naturels du micro-organisme hôte. Cela fait, commence la seconde étape, qui consiste à introduire dans l'organisme hôte toute une série de nouveaux gènes, codant les enzymes nécessaires. Celles-ci (en fait les gènes correspondants), qui peuvent appartenir à des organismes très différents (champignons, plantes, poissons, animaux, voire homme), sont choisies de façon à permettre la biotransformation en médicament (la molécule que l'on cherche à fabriquer) de la molécule "détournée" dans la première étape.

La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae, micro-organisme eucaryote qui est pourvu de structures cellulaires proches de celles des cellules de mammifères, permet la production stable et à bas prix de revient de protéines étrangères. Cet hôte apparaissait donc comme une solution intéressante pour la reconstruction de voies de biosynthèse artificielles complexes qui ne sont naturellement présentes que chez les organismes supérieurs. Autre avantage, on connaît parfaitement le génome de cet organisme, qui a été entièrement séquencé il y a quelques années dans le cadre d'un programme de recherche européen, et l'on sait également qu'il ne présente aucun risque potentiel en termes de biosécurité. En revanche, la levure présente un lourd handicap : elle ne réalise naturellement aucune des étapes menant à la synthèse des hormones stéroïdiennes humaines !

Il fallait donc reconstituer entièrement, chez la levure, la chaîne de biosynthèse humaine de l'hydrocortisone, en d'autres termes "l'humaniser", en y introduisant l'ensemble des gènes nécessaires. En fait, le problème était encore plus complexe que d'introduire simplement les gènes humains manquants : en effet, d'une part des gènes équivalents provenant d'autres espèces pouvannt s'avérer plus performants, une sélection s'est révélée nécessaire au sein de la biodiversité naturelle ; d'autre part, certains gènes naturels de l'hôte (la levure) se sont avérés gênants car ils créaient des réactions indésirables (à savoir, absentes chez l'homme mais présentes chez la levure). Il a fallu identifier ces "gènes parasites" et les détruire de façon raisonnée, c'est-à-dire pour empêcher ou limiter les réactions indésirables, mais de façon non létale pour la "poule aux oeufs d'or", c'est-à-dire la levure elle même.

Une autre difficulté majeure a été le problème de la "compartimentation". Chez l'homme en effet, plusieurs organes (le foie, les glandes surrénales, etc.) sont impliqués dans la synthèse du cortisol. La levure, un champignon unicellulaire mesurant quelques millièmes de millimètre seulement, n'a pas d'organe. Il a donc fallu reconstruire les choses un peu différemment de la nature, imaginer de nouvelles solutions, de nouvelles localisations pour les enzymes (les catalyseurs) nécessaires, afin de ne pas "tout mélanger" chez le microorganisme.

Mais les choses se compliquent quand l'on se trouve confronté à pratique : contrairement aux bactéries, chez qui tous les gènes assurant les différentes étapes de production d'une molécule donnée sont disposés sur le chromosome en une sorte de chaîne d'assemblage appelée opéron, chez les organismes supérieurs (eucaryotes), ils sont dispersés et interrompus par des portions d'ADN non codantes (introns). Du fait de la complexité de la structure des gènes eucaryotes, le transfert de gènes entre eucaryotes éloignés (Homme, Plantes, Champignons) est une opération complexe nécessitant une ingénierie moléculaire élaborée. Par conséquent, il s'est révélé nécessaire de reconstruire des gènes artificiels et d'assembler de toutes pièces, chez la levure, l'ensemble des fonctions aboutissant à la synthèse des hormones stéroïdiennes humaines et de l'hydrocortisone. Au total, une quinzaine de gènes ont dû être introduits ou modifiés puis leur fonctionnement soigneusement ajusté afin que chaque étape enzymatique s'effectue à la bonne vitesse et s'enchaîne harmonieusement avec les étapes en amont et aval : ainsi peut être évitée l'accumulation de produits intermédiaires ou la formation de produits indésirables. Cette tâche, elle-même extrêmement complexe, a été menée à bien en jouant sur la structure fine de chacun des gènes artificiels et sur le nombre de copies de chacun des gènes introduit dans la levure. De très nombreuses combinaisons ont dû être testées avant de trouver les "bons dosages" conduisant à un médicament exempt de contaminant.

Grâce à l'ensemble de cette ingénierie génétique, notre micro-organisme est maintenant une usine chimique capable de fabriquer de façon autonome, à partir du sucre et de l'alcool qui lui sont fournis, le médicament qui nous intéresse, sans la moindre aide du chimiste. L'ensemble du programme de fabrication ayant été intégré dans ses nouveaux gènes, il le recopiera sans effort à chacune de ses divisions. Ce micro-organisme génétiquement modifié pourra être endormi à tout moment par congélation et réveillé par simple culture. L'excédent sera, si nécessaire, facilement détruit par un traitement chimique simple, comme l'eau de Javel, ou par incinération, sans induire une quelconque pollution. Les usines biologiques ouvrent donc des perspectives des plus intéressantes en permettant la synthèse de molécules d'intérêt d'une grande complexité, à bas coût, sans pollution et avec une grande pureté.

Outre l'ingéniosité et la minutie remarquables de cette entreprise biotechnologique, ce travail se caractérise par l'audace qu'il a requise, notamment de la part du partenaire industriel qui a initié ce projet il y a une douzaine d'années, à une époque où peu d'outils biotechnologiques étaient disponibles et où, en particulier, les données de séquence des génomes, si utiles actuellement, étaient absentes. Cette réussite technologique, qui met en œuvre les toutes dernières connaissances fondamentales actuelles, est aussi un exemple remarquable de la manière donc un organisme de recherche orienté vers le fondamental, tel que le CNRS, peut s'associer en partenariat avec l'industrie afin de valoriser le travail de ses chercheurs dans les domaines économique et de la santé. Le travail d'ingénierie génétique publié dans la revue Nature Biotechnology est actuellement le plus complexe jamais réalisé dans le monde et met en évidence la place que la France peut prendre dans ce domaine hautement compétitif des biotechnologies. Il démontre aussi combien un effort pour le soutien et le développement de la recherche publique est important pour la compétitivité de notre économie, en permettant à nos entreprises d'avoir accès à des équipes de recherche de haut niveau dans le domaine des biotechnologies et de la santé.

Références :

Florence Ménard Szczebara ,Cathy Chandelier, Coralie Villeret, Amélie Masurel, Stéphane Bourot, Catherine Duport, Sophie Blanchard, Agnès Groisillier, Eric Testet, Patricia Costaglioli, Gilles Cauet, Eric Degryse, David Balbuena, Jacques Winter, Tilman Achstetter, Roberto Spagnoli, Denis Pompon and Bruno Dumas. Biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast. Nature Biotechnology à paraître dans le numéro de février 2003.
Accès en ligne possible à partir du 6 janvier sur le site de la revue.

Duport C., Spagnoli R., Degryse E. et D. Pompon. 1998. Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast. Nature Biotechnology, 16 (2), 186-189.

Contacts auteurs :

Florence Ménard Szczebara, Cathy Chandelier, Coralie Villeret, Amélie Masurel, Stéphane Bourot, Catherine Duport, Denis Pompon ont réalisé le travail présenté au Laboratoire d'Ingénierie des Protéines Membranaires du Centre de Génétique Moléculaire du CNRS, à Gif-sur-Yvette, France (F-91198).

Sophie Blanchard, Agnès Groisillier, Eric Testet, Patricia Costaglioli ont réalisé le travail présenté à l'École Supérieure de Technologie des Biomolécules de Bordeaux 2 (ESTBB), Université Victor Segalen Bordeaux 2, 146 rue Léo Saignat, F-33076 Bordeaux,

France Gilles Cauet, Eric Degryse, Tilman Achstetter ont réalisé le travail présenté à la société Transgene S.A., 11 rue de Molsheim, F-67082 Strasbourg, France

Jacques Winter, Roberto Spagnoli et Bruno Dumas ont réalisé le travail présenté à Aventis Pharma, Lead Discovery Technologies, 102 Route de Noisy, F-93235 Romainville, France et à Aventis Pharma, Functional Genomics, 13 Quai J. Guesdes, F-93400 Vitry sur Seine,Cedex, France

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Pour en savoir plus sur le CGM, visitez http://www.cgm.cnrs-gif.fr