Biogenèse des corps basaux et des structures contractiles associées

Figure 1. Ultra-structure d’un corps basal.
A gauche, la coupe longitudinale à travers le corps basal se prolonge dans le cil et montre la continuité des microtubules du corps basal au cil correspondant. A droite, coupes tranversales à différents niveaux du corps basal.
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Les corps basaux, à la base des cils et des flagelles et les centrioles dans le centrosome des cellules animales sont des organites subcellulaires homologues : même architecture (fig.1), mêmes fonctions de centres organisateurs du cytosquelette.

Comme le «spindle pole body» (spb), leur homologue fonctionnel chez la levure, centrioles et corps basaux se dupliquent une fois par cycle cellulaire et l’organite préexistant est généralement nécessaire à la genèse d'un nouveau centriole/corps basal, suggérant un mécanisme encore incompris de transmission d'information structurale particulièrement apparent pour le spb.Par sa grande taille, l’organisation répétitive de son cortex autour de quelque 4000 corps basaux, dont la duplication suit un patron spatio-temporel bien défini (fig. 2), la paramécie offre une accessibilité unique à l’étude de la biogenèse de corps basaux, car tout défaut spatial ou temporel, même léger, dans leur duplication ou l’organisation du cytosquelette cortical y est aisément repérable.

Parmi le petit nombre de protéines directement impliquées dans la duplication des spbs/centrioles/corps basaux, mais dont le mécanisme d’action reste à comprendre, nous étudions les centrines, petites protéines acides liant le Ca²⁺ très conservées chez les eucaryotes, et les protéines liant les centrines. Le prototype de cette nouvelle classe de protéines, Sf1p, identifié chez la levure, est nécessaire à la duplication du spb. Sfi1p se caractérise par la présence de nombreuses répétitions d’un motif consensus de liaison des centrines (Kilmartin JV., 2003, J Cell Biol 162:1211-21). Des homologues de Sfi1p sont présentes chez l’homme et chez la paramécie.

Figure 2. Organisation du cortex de la paramécie, montrant l’arrangemment des corps basaux. Chaque corps basal est ici révélé en fluorescence par la centrine PtCen2a (spécifique du corps basal) marquéee par la GFP. Les trois images montrent la face ventrale de la cellule, marquée en son centre par l’ouverture de l’appareil oral. A gauche, une cellule en interphase, au centre une cellule en début de division où la plupart des corps basaux se dupliquent, à droite une cellule à mi-division : l’allongement de la cellule s’accompagne de l’espacement des corps basaux. L’ordre et la régularité des duplications permettent d’en suivre exactemment le patron spatio-temporel et de connaître précisément, sur chaque cellule le lignage exact de chaque corps basal.
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Rôle des centrines dans la duplication des corps basaux

Si le rôle des centrines dans la duplication des spbs/centrioles/corps basaux est bien établi, leur mode d’action est loin d’être élucidé. La paramécie possède un grand nombre de gènes de centrines dont 4 (deux à deux homologues) sont phylogénétiquement reliés aux centrines humaines de type 2 et 3 respectivement (Ruiz et al., 2005, Curr Biol. 15(23):2097-106). Ces centrines sont localisées dans le cylindre centriolaire et certaines structures fibreuses associées. Comme dans d’autres systèmes, l’inactivation de l’un ou l’autre de 3 de ces gènes (PtCen2a, PtCen2b et PtCen3a) entraîne, en quelques divisions, une raréfaction des corps basaux (fig. 3a).

Dans la transmission des polarités au cours des divisions cellulaires, les centrines des corps basaux serviraient donc de relais, dont il s’agit d’identifier les partenaires.

Mais l’observation de cellules individuelles dès la première division en condition de RNAi (fig. 3b) a révélé que le rôle primaire de ces centrines est de définir le site et les polarités de la duplication et de permettre de rompre les liens entre corps basaux père et fils (Ruiz et al., 2005, Curr Biol. 15(23):2097-106). Mal positionnés, les corps basaux néoformés sont ultérieurement dégradés, d’où leur raréfaction.

Figure 3a. Inactivation du gène de centrine PtCen2a: phénotype terminal .
L’inactivation de ce gène conduit en 3-4 divisions à des cellules de morphologie anormale, de taille de plus en plus petite avec de moins en moins de corps basaux, ainsi qu’à une désorganisation de l’appareil oral dont les nombreux cils et corps basaux sont nécessaires à l’ingestion de la nourriture, aboutissant ainsi à l’arrêt de croissance et la mort par inanition. La cellule traitée est indiquée par une tête de flèche, la cellule témoin par une flèche ; les corps basaux sont visualisés par un anticorps anti-tubuline. Barre : 10 mm.

Figure 3b. Inactivation du gène de centrine PtCen2a : effet primaire détecté en microscopie électronique sur des cellules effectuant leur première division en condition d’inactivation.
A gauche, en coupe transversale, est présenté un stade précoce de duplication normale des corps basaux : le corps basal néo-formé se développe perpendiculairement à son “père” (flèche rouge) avant de s’allonger, se redresser parallèlement à son père, le long du même axe antéro-postérieur de la cellule. Le schéma correspondant en bleu à gauche visualise les polarités (Ant/Post et Right/left) des corps basaux et de la cellule. Ces polarités sont matérialisées par la racine ciliaire (flèche blanche) orientée vers l’avant et la droite de la cellule et du corps basal. Dans les cellules inactivées, à droite, les corps basaux se dupliquent, mais le positionnement des corps basaux fils est anorma l: l’image du haut, en coupe transversale comme le témoin, montre un bourgeon à côté de l’axe antéro-postérieur ; l’image du bas, en coupe longitudinale montre un corps basal fils qui a acquis sa taille adulte, mais est resté lié à son père et n’a pas rejoint sa place, parallèle à lui, dans le cortex.
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Les complexes centrines/protéines de liaison des centrines de type Sfi1 : l’exemple du réseau infracililiaire

L’étude chez la levure de la fonction de sfi1p a permis de proposer un modèle pour la duplication du spb (Salisbury JL., 2004, Curr Biol 14:R27-9 ; Li S. et al., 2006, J Cell Biol 173:867-77) : les centrines s’aligneraient le long des molécules de Sfi1p comme des perles sur le fil d’un collier et leur changement de conformation en présence de Ca²⁺ entraînerait la contractilité du complexe.

Mais il reste :

1) à analyser les propriétés des complexes formés par les centrines et leurs protéines de liaison, en particulier leur contractilité, et des études structurales de ce système sont en cours dans divers laboratoires (Li S. et al., 2006, J Cell Biol 173:867-77 ; Martinez-Sanz et al., 2006, FEBS J. 273:4504-15; Sheehan JH. et al., 2006, J Biol Chem 281:2876-81 ),
2) à comprendre leur rôle exact dans la duplication du spb et
3) à montrer leur rôle éventuel dans la duplication des corps basaux et des centrioles.

Figure 4a. Le réseau infraciliaire : organisation cellulaire
Le réseau (ICL), visualisé en immunofluorescence par un anticorps anti-centrine, forme un filet sous-cortical qui sous-tend toute la surface cellulaire. Le marquage en rouge des corps basaux par un anti-tubuline montre que les mailles du filet s’organisent en relation avec et autour des corps basaux, comme le souligne l’insert agrandi en haut à droite.

Le réseau infraciliaire (ICL pour “InfraCiliary Lattice") de la Paramécie offre un modèle pour aborder divers aspects de ces problèmes. L’ICL est un réseau cytosquelettique cortical formé de faisceaux de microfilaments qui sous-tend toute la surface cellulaire (fig. 4a, b).

En réponse à un influx de Ca²⁺, la contraction de l’ICL entraîne un raccourcissement de la cellule (fig. 4c). L’ICL se révèle composé de centrines et de protéines liant les centrines. Les premières centrines du réseau infraciliaires avaient été caractérisées précédemment, et leur fonction spécifique dans le réseau démontrée (Madeddu et al., 1996, Eur J Biochem 238(1):121-8 ; Klotz C. et al., 1997, Cell Motil Cytoskeleton 38(2):172-86 ; Ruiz F. et al., 1998, Mol Biol Cell. 9(4):931-43). Partant de la séquence du génome, nous entreprenons une analyse protéomique du réseau infraciliaire purifié afin d’en identifier tous les composants. Notre objectif à terme est de mettre en œuvre deux types d’approches pour analyser l’organisation et la fonction de ces multiples composants : localisation des différentes protéines marquées par la GFP et analyse cytologique et moléculaire des effets de l’inactivation des différents gènes par RNAi.

Figure 4b. Ultrastructure du réseau infraciliaire
Cette coupe tangentielle sous-corticale, perpendiculaire à l’axe des corps basaux (bb) les coupe dans leur partie proximale, au niveau de laquelle se trouve le réseau infraciliaire (ICL). Le réseau apparaît constitué de faisceaux de microfilaments formant des mailles polygonales, pour l’essentiel organisées autour des corps basaux, parfois enserrant la pointe d’un trichocyste (granule de sécrétion) (tt).
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Figure 4c. Contractilité du réseau infraciliaire
En présence d’un influx de Ca²⁺, la paramécie subit un rapide raccourcissement, qui est dû à la contraction du réseau infraciliaire, visualisé par un anticorps anti-centrine. En effet, les cellules dépourvues de réseau infraciliaire, par suite de l’inactivation d’une des centrines constitutives (Beisson et al., 2003), ne montrent aucun raccourcissement dans les mêmes conditions. L’influx de calcium peut être provoqué par exposition à un sécrétagoque vital, l’aminoéthyl dextan (Plattner et al., 1984, Exp Cell Res 151:6-13). Le phénomène de contraction est observable à la loupe binoculaire, dans les secondes suivant le transfert de la cellule dans la solution test.
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Réseau infraciliaire et corps basaux

Le réseau infraciliaire n’est pas seulement une structure exotique offrant un modèle amplifié et manipulable des complexes centrines/protéines de liaison. Il a été montré que sa biogénèse est intimement liée à celle des corps basaux (fig. 5). Quand le réseau a été désassemblé, son réassemblage est amorcé dans une région définie du matériel “péri-corps basal” (Beisson et al., 2002 Protist 152: 339-354), comme c’est le cas pour les autres “appendices” du corps basal, les ubiquitaires racines ciliaires ou les fibres contractiles associées au corps basaux des Chlamydomonas, par exemple. Comprendre la genèse des sites de nucléation du réseau infraciliaire, leur relation avec les centrines spécifiques des corps basaux, est susceptible d’apporter des éléments de réponse au problème du rôle de ces complexes dans la duplication des structures centriolaires elles-mêmes.

Figure 5. Centre organisateur de l’ICL
Cette image montre une cellule après le désassemblage complet de l’ICL qui peut être provoqué par inactivation du gène d’une des centrines constitutives (Beisson et al., 2002). Dans de telles cellules, dont l’état se maintient par continuité cellulaire, un micro-foyer de matériel réagissant, comme l’ICL, avec les anticorps anti-centrines, subsiste, à proximité de chaque corps basal. Lorsque le gène éteint est réactivé, les faisceaux de microfilaments se reforment, mais exclusivement à partir des micro-foyers pré-existants, nommés ICLOCs pour ICL Organizing Centers.
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Biogénèse des cils : la paramécie comme modèle pour l’étude de maladies génétiques humaines

Depuis quelques années, on découvre que de nombreuses maladies génétiques humaines responsables de malformations multiples (Hydrocéphalie, Exencéphalie, Stérilité masculine, Polykistose rénale, Syndrome de Bardet-Biedl, Syndrome oro-facio-digital Type 1, Dyskinésie ciliaire, Kartagener, Néphropathie) résultent de mutations affectant des gènes qui codent des protéines impliquées dans le fonctionnement ou l’assemblage des cils, des flagelles ou de leurs corps basaux. Or, comme les organelles elles-mêmes, ces gènes ont été remarquablement conservés au cours de l’évolution. Les analyses comparées in silico des génomes de différents organismes pourvus, ou au contraire dépourvus de structures ciliaires ou flagellaires (Li et al., 2004, Cell, 117(4):541-52) ont a ainsi permis d'identifier plus de 500 gènes susceptibles de coder pour des constituants des cils et corps basaux. Des analyses plus directes de protéomique réalisées sur des flagelles purifiés de Chlamydomonas (Pazour et al., 2005, J Cell Biol 170(1):103-13) indiquent qu’au moins 652 protéines constituent ce seul organite.

Parmi les organismes modèles, la paramécie présente le triple avantage d’avoir un génome complètement séquencé et annoté, de se prêter aisément à l’étude fonctionnelle des gènes par ARN interférence et bien sûr d’avoir de nombreux cils (fig. 6) dont la biogénèse et les propriétés sont aisément observables.

Figure 6a. La ciliature d’une paramécie vue en immunofluorescence (anticorps antitubuline.
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Notre approche est :

(1) d’identifier les protéines des cils et des corps basaux, par génomique comparative et par analyse du protéome des cils en spectrométrie de masse et

(2) d’analyser par des méthodes fonctionnelles (ARN interférence, localisation des fusions GFP), les gènes connus ou candidats dont le dysfonctionnement provoque des maladies chez l’homme. Les gènes MKS3 et DNAI1, dont le dysfonctionnement provoque chez l’homme respectivement une encéphalopathie et une dyskinésie ciliaire, montrent déjà que cette approche est possible, car leur inactivation donne un phénotype clair de perturbation du battement ciliaire. Nous comptons donc développer cet aspect modèle de la paramécie pour l’étude de maladies touchant les cils et flagelles.

Fig. 6b Les deux coupes, respectivement perpendiculaire (à gauche) et parallèle (à droite) à la surface cellulaire montrent la continuité du cylindre de 9 doublets de microtubules depuis le corps basal jusqu’à la pointe du cil et la continuité de la membrane plasmique avec la membrane ciliaire. Tout cil se développe à partir d’un corps basal. Les cils motiles se caractérisent par la présence d’un doublet central de microtubules, absent dans le corps basal.
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